目的：众所周知，云南个旧是矿工职业性肺癌的高发区。其发生与多种基因的表达异常及相互关系相关，要弄清楚其确切的机制，需要对差异性表达的基因进行克隆、筛选和鉴定。在众多研究基因表达差异的方法当中，抑制性消减杂交(SSH)技术是最行之有效的方法，它筛选效率高、特异性高、灵敏度高、能有效分离高、低丰度的差异表达基因。本研究利用既往建立的个旧矿粉体外诱导的永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化模型，克隆和鉴定BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段，以期从基因水平上探讨个旧矿粉体外诱导BEAS-2B发生恶性转化的分子学机理，为揭示个旧矿工肺癌的致癌机制提供科学依据，为寻找个旧矿工肺癌诊断和治疗的靶点提供新的研究方向。 方法：1)差异表达基因的分离：以BEAS-2B为对照组，以恶性转化细胞为实验组，分别提取总RNA，并分离纯化mRNA；采用SMART cDNA合成技术，获得足够量的ds cDNA；应用SSH技术分离BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段。2)差异表达基因的克隆：通过 T/A 克隆和蓝白筛选实验，克隆BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段，构建二者之间差异表达的cDNA消减文库。3)差异表达基因的筛选：挑取白色菌斑，通过菌液PCR法或提取质粒并进行酶切鉴定技术进行初步筛选。4)DNA序列测定及同源性分析：对阳性基因片段进行DNA序列测定，并通过BLAST软件在GenBank数据库中对测序结果进行同源性分析。5)差异表达基因的鉴定：对经同源性分析获得的阳性基因片段，采用Dot Blot或Northern Blot鉴定差异表达的基因片段。6)差异表达基因的分析：应用生物信息学技术对已知基因进行突变检测和功能分析。 结果：1)通过SSH和T/A克隆等技术成功构建了具有较高消减效率的BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库，文库中含有107个白色克隆。2)通过菌液PCR法或提取质粒并进行酶切鉴定技术对全部白色克隆进行初步筛选，获得101个阳性克隆。3)对101个阳性基因片段进行DNA序列测定，并对其进行同源性分析，发现它们中有44条基因片段代表20种已知基因，36条基因14种已知EST和6种新EST代表的目的片段进行Dot blot或Northern blot鉴定，除1种已知基因为假阳性片段外，余39种序列均为BEAS-2B与其恶性转化细胞之间差异表达的基因片段。5)应用生物学信息技术对19种已知基因进行突变分析，发现B<,2>微球蛋白(B2M)mRNA的第338位碱基发生C→T转换导致其第93位氨基酸由苏氨酸(Thr，T)变为异亮氨酸(Ile，I)；CCR4-NOT转录复合物亚单位7(CNOT7)mRNA的第391位碱基发生T→C转换，第672位碱基发生A→G转换，它们分别导致其第31位氨基酸由异亮氨酸(Ile，I)变为苏氨酸(Thr，T)，第125位氨基酸由赖氨酸(Lys，K)变为谷氨酸(Glu，E)。6)对鉴定出的19种已知基因进行功能分析，发现它们有的功能未知，有的涉及细胞的生长、分化、代谢、运动、凋亡、转录、翻译、信号转导、免疫和防御反应以及细胞外基质的降解等多个方面的功能。 结论：1)SSH技术成功地构建了具有高消减效率的BEAS-2B与其个旧矿粉诱导的恶性转化细胞之间差异表达的cDNA消减文库，同时表明该技术是寻找差异表达基因的一种行之有效的方法。2)改良后的菌液 PCR法是一种高效的筛选载体中目的片段的方法，值得推广。3)在个旧矿粉体外诱导BEAS-2B发生恶性转化的过程中，有多个差异表达基因片段参与其中。这些差异表达基因在个旧矿粉诱导的恶性转化细胞中的表达上调以及B2M、CNOT7的突变可能在个旧矿粉体外诱导BEAS-2B恶性转化过程中发挥着重要的作用，它们的发现为揭示个旧矿工肺癌的致癌机制提供了科学依据。4)在克隆鉴定出的差异表达基因片段中，发现有6种为新EST，它们有可能代表新基因。已将其序列提交至GenBank数据库，现已获得GenBank注册号。这些新发现为个旧矿工肺癌发病机理的深入研究及其防治提供了新的研究方向。5)在克隆鉴定出的19种已知基因中，有6种基因曾被报道过与肺癌相关，说明个旧矿工肺癌与其他肺癌在发病机理方面具有相似之处(共性)。有13种基因首次发现与肺癌相关，它们的发现说明个旧矿工肺癌与其他肺癌在发病机理方面确实存在特殊性，这可能与个旧矿粉特殊的诱癌机制有关。6)本研究结果与国内外报道的采用SSH技术克隆和鉴定的肺癌相关差异表达基因比较，有3种基因曾被报道在肺癌组织或肺癌细胞中高表达，有16种基因首次出现于SSH技术构建的肺癌cDNA消减文库中，它们的发现对于构建和完善肺癌基因文库具有重要的意义。
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