研究背景:结核病是人类主要传染病之一.目前,无论是发达国家还是发展中国家,结核病疫情又呈上升之势.结核病仍然是威胁人类健康的重要疾病之一.同时,由于耐药及多重耐药菌株的出现,给结核病人的治疗带来严重困难.研制新的抗结核药物成为当务之急,从具有毒副作用少、不易产生耐药性等优点的中药中寻找新的抗结核药物,也引起人们的广泛重视.现有评价药物杀菌活性的体外试验方法主要是测定药物的MIC,其在抗结核药物活性研究中有着明显的缺陷.由于现有抗结核药物均存在副作用大,易产生耐药性等缺点.同时从化学合成物中寻找有效药物的难度日益增大,因而,近年国际上十分重视对副作用小且不易产生耐药的天然药物的开发研究.但目前对抗结核中药的研究尚存在研究方法的缺陷,以及研究者思维习惯等因素的制约.如目前常用的体外MIC试验在中药抗结核活性研究中存在严重缺陷,研究者过多强调对中药活性成分的筛选、分离和纯化,忽略了中药的整体性作用等.与此同时,在中药及结核杆菌研究中出现了诸多新的方法和手段,为更好地进行中药抗结核活性研究提供了借鉴.在抗结核药物活性研究中尚缺乏更为科学、可控性好、实用性强的体外评价方法.目的:①建立基于含药血清及MФ模型的抗结核杆菌药物活性评价方法;探讨含药血清及MФ模型在抗结核杆菌药物活性评价中的应用;②利用含药血清及MФ模型,结合传统MIC方法共同评价中药短萼海桐提取液的抗结核杆菌活性,进一步探讨含药血清及MФ评价模型,在中药抗结核杆菌活性评价中的应用.方法:①以小鼠腹腔MФ的TB感染模型与异烟肼含药血清的共培养体系,作为抗结核药物活性的评价体系,以异烟肼含药血清与感染MФ共同培养数天后,破碎MФ释出其内存活的结核杆菌进行体外培养,通过最终形成的菌落数,反映异烟肼抗结核活性在该评价体系中的表达情况.设血清及空白对照组.评价结果以传统MIC结果作参照.通过台盼兰染色后记数活细胞百分率,反映不同浓度药物及其含药血清与细胞共同培养后对细胞活力的影响.②应用短萼海桐提取液的含药血清及MФ的TB感染细胞模型评价短萼海桐的抗结核杆菌活性,设阳性(异烟肼)及阴性(空白、血清)对照组;再采用传统最低抑菌浓度测定法,即二倍稀释法测定短萼海桐提取液的MIC值,结合体内抗结核实验,对应用短萼海桐提取液的含药血清及MФ的TB感染细胞模型获得的评价结果予以验证;通过台盼兰染色后记数活细胞百分率,反映不同浓度药物及含药血清与细胞共同培养后对细胞活力的影响;以MФ吞噬实验探讨短萼海桐提取液的含药血清对MФ免疫功能的影响.结果:①体外最低抑菌浓度试验得出,试验用异烟肼的最低抑菌浓度为:0.11±0.024;②台盼兰染色后记数活细胞的百分率,异烟肼低剂量血清组大于其MIC值浓度含药组(p<0.01),高剂量血清组大于高剂量含药组(p<0.01),各实验组活细胞的百分率均低于对照组(p<0.01);③在感染TB的MФ与异烟肼或其含药血清共同培养数天后,异烟肼含药组及含药血清组MФ中存活的细菌数,与对照组比较均有显著减少(p<0.01),异烟肼的抗结核活性在该体系中得到充分反映.④短萼海桐提取液在体外具有明确的抑菌范围,其在浓度0.25~0.5mg/ml时对结核杆菌的生长有明显的抑制作用;⑤短萼海桐提取液在其含药血清及M①感染模型组成的评价体系中,能使MФ中的感染细菌存活数明显减少.表现为:在感染TB的MФ与短萼海桐提取液或其含药血清共同培养数天后,中药高剂量血清组能使MФ中存活的细菌数显著减少(p<0.01);⑥小鼠体内抗结核实验,中药高、低剂量组小鼠半数死亡时间均显著长于对照组,中药高、低剂量组小鼠生存率显著高于对照组(p<0.01),中药各组及异烟肼组小鼠脏器损害均轻于对照组;⑦台盼兰染色后记数活细胞的百分率,中药含药组均低于其相应含药血清组(p<0.01),且高剂含药组低于低剂含药组(p<0.01),高剂量含药血清组低于低剂量含药血清组(p<0.01).各实验组活细胞的百分率均低于对照组(p<0.01);⑧短萼海桐提取液及其含药血清对巨噬细胞免疫功能具有促进作用(p<0.01).结论:①应用含药血清及巨噬细胞模型能对药物的抗结核杆菌活性进行评价.为抗结核药物研究提供了新的方法和手段;②体外及体内实验证实短萼海桐提取液具有较好抗结核作用;③通过含药血清及巨噬细模型能反映出短萼海桐的抗结核杆菌活性,且这种活性可能通过其有效成分对感染细胞免疫功能及其内细菌的整体作用得以发挥;利用含药血清及巨噬细模型可以对中药短萼海桐抗结核杆菌活性及其浓度与细胞毒性的关系等作出较全面的评价.
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