[1]大理大学公共卫生学院
[2]云南省传染病医院
[3]云南省畜牧兽医科学院,云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室
[4]昆明医科大学公共卫生学院
[5]云南省昆明市东川区动物疫病预防控制中心
目的 分离云南省昆明市东川区三带喙库蚊携带的乙型脑炎病毒，分析其分子特征，为云南省乙型脑炎防治提供科学依据。方法 2016年7月，在云南省昆明市东川区坝塘村、小新村养猪场采用诱蚊灯采集蚊虫标本，根据蚊虫形态进行蚊种鉴定。每种蚊虫均按60～100只为一组进行研磨后，采用乳仓鼠肾BHK-21细胞和C6/36白蚊伊蚊细胞进行病毒分离，阳性分离物采用黄病毒属引物进行鉴定。采用15对覆盖Ⅰ型基因型乙型脑炎病毒全长特异性引物对阳性分离物进行逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）扩增，采用DNASTAR软件包中的SeqMan软件进行序列拼接，采用MegAlign软件对所获取序列及从GenBank中下载的38条乙型脑炎病毒全序列进行比对、核苷酸和氨基酸同源性分析，采用GeneDoc软件进行氨基酸差异位点分析，采用Mega X软件构建所分离乙型脑炎病毒编码区及E蛋白序列的系统进化树，分别采用SOPMA在线工具和Swiss-Model软件进行E蛋白二级和三级结构预测。结果 共采集蚊虫5 820只，经形态学鉴定，共有三带喙库蚊3 843只（66.03%）。将蚊虫标本分批次进行病毒分离，从三带喙库蚊中分离到1株阳性病毒分离物，编号为YNDC55-33。将其接种至BHK-21和C6/36细胞后均出现细胞病变，黄病毒属引物扩增均为阳性，测序获得含300个核苷酸的长序列。经BLAST比对，YNDC55-33株病毒该段序列与Ⅰ型基因型乙型脑炎病毒同源性较高。对该株病毒全序列进行拼接后，获得一条长度为10 845个核苷酸的长序列，编码3 432个氨基酸。基于全基因序列和E基因序列构建的系统进化树分析结果显示，新分离的YNDC55-33株与贵州Ⅰ型基因型毒株（GenBank登录号：HM366552）亲缘关系最近，核苷酸同源性为98.5%、氨基酸同源性为99.4%；与Ⅰ型基因型其他乙型脑炎病毒毒株核苷酸同源性为97.96%±0.33%、氨基酸同源性为99.35%±0.08%；与其他基因型核苷酸同源性均<90%、氨基酸同源性均<98%。氨基酸位点分析结果显示，YNDC55-33株与减毒活疫苗株SA14-14-2在E基因上共有16个氨基酸差异位点；在8个与神经毒力相关氨基酸关键位点上，两者有7个位点存在差异。YNDC55-33株E蛋白二级结构及三级结构预测结果均显示，该毒株以无规则卷曲为主要结构特征。结论 在昆明市东川区三带喙库蚊体内分离得到1株氨基酸型乙型脑炎病毒，该病毒与减毒活疫苗株SA14-14-2在抗原性表位相关关键氨基酸位点上无明显差异，其主要蛋白结构为无规则卷曲。本研究丰富了云南省乙型脑炎病毒分布资料，可望为云南省流行性乙型脑炎防控提供参考。
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